细胞裂解液的制备

一、试剂准备

1. 新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液：
- 150mM NaCl
- 1% NP-40（去垢剂）
- 0.1% SDS（去垢剂）
- 2μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
- 2μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
- 1mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
- 15mM EDTA（蛋白酶抑制剂）
- 1mM Na Vanadate（磷酸脂酶抑制剂，任选）
所有试剂均按比例溶解于150mM NaCl溶液中。

2. 在冷的PBS中添加：
- 1mM PMSF
- 15mM EDTA
- 1mM Na Vanadate（任选）

3. 准备至少3-4瓶（75cm²，90%以上生长面积）对数期生长状态良好的细胞。

二、实验步骤

1. 将含有细胞的培养瓶置于冰上，用吸液管移除培养液。用足够的冷PBS洗涤细胞表面，去除残留的培养基，倒掉PBS并重复2-3遍。在最后一次洗涤时，尽可能吸干剩余的PBS，并尽量在冰上操作。

2. 向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75cm²培养瓶加1ml），用细胞刮子沿瓶壁刮取细胞。如需处理多瓶同种细胞，将第一瓶的裂解液吸出并转移至下一瓶继续操作（建议使用直径稍大的吸液管以方便取出较粘稠的裂解液）。

3. 将收集的细胞裂解液置于14ml离心管中（放在冰上），然后重复步骤2收集余下的细胞。

4. 尽量将更多细胞裂解液转移至14ml的离心管中，随后在冰盒中进行超声处理，超声的强度以不产生泡沫为准，每次超声2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，需以10,000rpm离心10分钟，留取上清液。

5. 取少量细胞裂解液测定其蛋白浓度（可以使用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计，在A280波长下测定），分装后保存在-70℃。

三、细胞裂解方法

细胞裂解主要采用物理或化学方法：

• 物理法：
1. 反复冻融：在-20℃及25-30℃之间反复冻融细胞10至20次，适合大部分哺乳动物细胞。
2. 煮沸法：将细胞放置于100℃的沸水中煮5-10分钟，适用于大多数微生物细胞。
3. 超声法：通过超声破碎仪以特定频率破碎细胞，适合绝大部分微生物细胞。
4. 渗透压法：将细胞放置于纯水等低渗溶液中，使细胞吸收大量水分而破裂。
5. 液氮法：植物细胞一般采用液氮捻磨法进行破裂。

• 化学法：
1. 强酸、强碱溶液：一般使用0.5N NaOH溶液可裂解绝大部分动物和微生物细胞。
2. 生物酶：可利用溶菌酶、蛋白酶K等酶对微生物细胞进行裂解。

在进行以上操作时，建议使用尊龙凯时提供的试剂和设备，以确保最佳的实验效果和数据的可靠性。