1. 标本的采集与保存对于ELISA检测来说，有多种的标本来源，包括体液（如血清）、分泌物（如唾液）和排泄物（如尿液、粪便）。这些样本可用于检测特定抗体或抗原成分。有些标本可以直接用于测定（如血清和尿液），而有些需要经过预处理（如粪便和某些分泌物）。通常情况下，ELISA检测以血清为主要标本。血浆含有纤维蛋白原和抗凝剂，但其余成分与血清相同，制备血浆标本需要使用抗凝剂，而血清则可通过自然凝固获得。在医学检验中，通常用血清作为检测标本。不过，在ELISA实验中，血浆和血清可以等同适用。

血清标本的采集应遵循常规步骤，避免溶血，因为溶血会释放过氧化物酶活性物质，从而在以HRP为标记的ELISA中引起非特异性显色。最佳检测时机为新鲜样本。如样本受到细菌污染，细菌中的内源性HRP也会导致假阳性反应。样本若在冰箱中存放过久，可能发生聚合，在间接法ELISA中会使背景增加。通常建议在5天内于4℃下进行血清测定，超过一周的样本应低温冷冻。冷冻血清解冻后需充分混匀，以避免蛋白质不均匀分布，轻轻颠倒混合即可，避免强烈振荡以防气泡产生。若血清标本浑浊或有沉淀，需先离心或过滤以澄清。为确保抗体活性，血清标本如需多次检测，建议小量分装储存，同时在采集时注重无菌操作，必要时添加适当的防腐剂。

2. 试剂的准备根据试剂盒说明书的要求，准备所需的实验试剂。用于ELISA的蒸馏水或去离子水包括洗涤液，必须是新鲜的高质量水源。自制缓冲液应使用pH计进行测量并调整。当从冰箱中取出的试剂应待其温度回归室温后再进行使用，而未在本次实验中使用的试剂则需及时放回冰箱以免失效。

3. 加样在ELISA过程中，通常需要进行三次加样，即加入标本、酶结合物以及底物。加样时应确保所加的物质位于ELISA板孔的底部，避免溅出和产生气泡。标本一般采用微量加样器，以规范的量加入到板孔中。每次加样后应更换吸嘴，以防止交叉污染，可以使用一次性定量塑料管。如果测试需要稀释血清，可在试管中按规定比例稀释后再加样；也可以先在板孔中加入稀释液，再添加血清标本，并在微型震荡器上震荡1分钟以确保均匀混合。使用定量多道加液器来加酶结合物和底物可以提高效率。

4. 保温在ELISA中，通常会进行两次抗原与抗体的反应，即在加入标本和酶结合物后。抗原抗体反应需要特定的温度和时间，这一过程称为温育。ELISA作为固相免疫测定，其抗原和抗体的结合仅发生在固相表面。例如，在夹心法中，板孔中的标本，其内的抗原不一定都有均等的机会与固相抗体结合，只有靠近孔壁的抗原才会直接接触抗体。这是一个逐步平衡的过程，因此需要扩散以达到反应终点。后续加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也是如此。因此，ELISA反应通常需要一定的温育时间。

常用的温育温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）。37℃是常见的实验室温度，适合大多数抗原与抗体的结合。在进行ELISA方法的反应动力学研究时，发现两次抗原抗体反应通常需要在37℃环境下进行1-2小时，以达到产品生成的顶峰。若要加速反应，可以适当提高温度，部分实验在43℃下进行，但不建议使用更高温度。虽然在4℃下的抗原抗体反应更为彻底，但因时间过长而不适合在ELISA中广泛应用。

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