细胞冻存是一种在低温环境中保存细胞的方法，旨在降低其代谢活性，从而实现长期保存和保种，以备未来的实验或临床使用。一般遵循慢冻原则，以减少大冰晶的形成，从而避免对细胞的损害。

一、冻存原理

当温度降至-70℃时，细胞内的代谢活动及酶活性几乎完全停止，低于-130℃时细胞能够达到最佳存活率。液氮可确保细胞得到有效的长期保存。同时，冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能够快速穿透细胞膜，降低冰点，延缓冻存过程，增加细胞膜的通透性，提升细胞内离子浓度，进而减少细胞内冰晶的形成，达到保护细胞的目的。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液；
2. 用PBS冲洗细胞，添加胰酶消化（此步骤与细胞传代相同）；
3. 消化结束后重悬细胞，转移至无菌EP管，并以1000rpm离心5分钟；
4. 弃去上清，加入预热的细胞冻存液，最佳细胞冻存密度为5×10⁶~1×10⁷/ml，一般不低于5×10⁵/ml；
5. 分装后拧紧冻存管盖并做好标记；
6. 将分装好的冻存管放入程序降温盒，置于-80℃冰箱中过夜；
7. 将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 用移液管充分混匀细胞悬液，转入离心管；
2. 以1000rpm离心3分钟，收集细胞沉淀；
3. 用预热的冻存液重悬细胞，最佳冻存密度为3-5×10⁶/ml，一般不低于5×10⁵/ml；
4. 分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；
5. 将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱中过夜；
6. 然后将冻存管转移至液氮进行长期保存。

注意事项

• 细胞培养、传代及冻存过程中必须严格遵循无菌操作。
• 传代时需适度消化，消化时间受多种因素影响，观察细胞形态变化，一旦发生细胞质回缩或连接变松，则应立即终止消化。
• 传代应在细胞处于对数生长期、未达汇合状态时进行。
• 冻存液需提前配制，切勿直接将DMSO加入细胞悬液中。
• 应选择汇合度为80%-90%、活力达90%以上的细胞进行冻存，以确保最佳冻存状态，冻存密度可根据细胞特性调整。
• 程序降温盒、细胞冻存液、完全培养基等试剂都需预热至室温。
• 注意防止消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过高或离心时间过长，以免造成细胞损伤。
• 冻存管的盖子必须拧紧，以免水浴复苏时水分渗入导致污染。
• 细胞不应长期存放于-80℃冰箱，放置时间应控制在3天以内。
• 细胞需在干冰或冰盒中运输至细胞房，以防止温度变化。

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